Ultra HiFidelity PCR-Kit

High Fidelity, hohe Spezifität und hocheffiziente Hot-Start-PCR-Premix.

Das Ultra HiFidelity PCR Kit ist ein neuer High-Fidelity-PCR-Amplifikations-Premix, der sich für die PCR-bezogene Klonierung und Detektion eignet. Die im Kit enthaltene Ultra-HiFi-DNA-Polymerase ist eine neue schnelle und hochgenaue DNA-Polymerase, die durch die Technologie der gerichteten molekularen Evolution entwickelt wurde. Es erhöht die Affinität der DNA-Polymerase zu Matrizen, verbessert die Amplifikationsgeschwindigkeit und die Verlängerungsfähigkeit des Enzyms und erhöht die Erfolgsrate der PCR und die Produktausbeute.

Katze. Nein Packungsgröße
4992970 1ml
4992971 5*1ml
4992978 5*5*1ml

 

 


Produktdetail

Experimentelles Beispiel

FAQ

Produkt Tags

Merkmale

■ Einfache Handhabung: Dieses Kit wird als 2×-Premix geliefert und die PCR kann durch einfaches Hinzufügen von Templates und Primern durchgeführt werden.
■ Hohe Wiedergabetreue: Die Wiedergabetreue ist 50-mal höher als die von Taq-Polymerase.
■ Hohe Spezifität: Hervorragende Heißstartleistung zur Sicherstellung der Produktspezifität.
■ Schnelle Verstärkung: Die Verlängerungsgeschwindigkeit kann 10-15 s/kb erreichen.
■ Starke Erweiterbarkeit: Bis zu 20 kb DNA-Fragmente können amplifiziert werden.
■ Breite Anwendbarkeit: Das Kit enthält PCR Enhancer und eignet sich für die Amplifikation von High GC und komplexen Templates.

Spezifikation

Typ: High-Fidelity-DNA-Polymerase
Verstärkungsgeschwindigkeit: 10-15 Sek./kb
Fragmentgröße: <20kb
Anwendungen: High-Fidelity-PCR-Amplifikation, Genklonierung, High-GC-Template-Amplifikation, Genklonierung komplexer Genome, cDNA-High-Fidelity-Amplifikation, SNP-Detektion, ortsspezifische Mutation usw.
DNA-Extraktionsausbeute aus verschiedenen Pflanzengeweben:
Hinweis: DNA-Ausbeute hängt von den Probentypen ab. Alle oben genannten Materialien sind aus zarten Blättern.

Alle Produkte können für ODM/OEM angepasst werden. Für Details,Bitte klicken Sie auf kundenspezifischen Service (ODM/OEM)


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    Experimental Example Hot-Start zur Sicherstellung der Produktspezifität
    Abbildung 1. Ultra HiFi verfügt über eine hervorragende Hot-Start-Funktion, um die Spezifität der Amplifikationsprodukte sicherzustellen. Es wurde die Molecular Beacons-Methode angewendet (Ma et al., Anal Biochem, 2006).
    Experimental Example Ausgezeichnete High Fidelity, 50-mal höher als Taq Polymerase
    Abbildung 2. Die Wiedergabetreue von Ultra HiFi ist 50-mal höher als die von herkömmlicher Taq-Polymerase. Als Referenz wird die Polymerisationstreue der Taq-Polymerase (ohne korrigierende Aktivität) verwendet.
    Experimental Example Schnelle Amplifikation und lange Fragmente können schnell amplifiziert werden
    Abb. 3. Ultra HiFi kann für Fragmente kleiner als 4 kb bis zu 5 s/kb erweitert werden. Bei langen Fragmenten kann die Amplifikationszeit entsprechend verlängert werden. Bei Fragmenten mit mehr als 15 kb kann die Ausdehnungsgeschwindigkeit bis zu 30 s/kb betragen. M: TIANGEN D15000 Markierung
    Experimental Example Experimental Example Experimental Example Starke Universalität und hohe Spezifität, leicht lesbare hohe GC und lange Fragmente aus verschiedenen Quellen
    Abbildung 4. Ultra HiFi hat eine hohe Spezifität, um die Erfolgsrate der Amplifikation und die Produktmenge für verschiedene Arten von Templates sicherzustellen.
    A. Ergebnisse der Ultra-HiFi-Verstärkung
    B. Ergebnisse der Hi-Fi-Enzymverstärkung von Lieferant K
    C. Ergebnisse der Hi-Fi-Enzymverstärkung von Lieferant N
    M: TIANGEN D15000 Markierung
    Bahn 1-5. Amplifikationsergebnisse von Templates mit unterschiedlicher Länge: 1. 750 bp; 2. 1 KB; 3.
    2 KB; 4. 4 kb; 5. 6 kb
    Spur 6. Amplifikationsergebnis des Templats mit hohem GC: 1915 bp (GC%: 70%);
    Bahn 7-11. Amplifikationsergebnis von 2 kb-Matrizen aus verschiedenen Genomen: 7. Ratte; 8.
    Reis; 9. Weizen; 10. Mais; 11. Bakterien;
    Bahn 12-14. Ergebnis der Amplifikation eines 8 kb langen Fragments: 12. Reis; 13. Mais;
    F: Keine Verstärkungsbänder

    A-1 Vorlage

    ■ Das Template enthält Proteinverunreinigungen oder Taq-Inhibitoren usw. ——Reinigen Sie das DNA-Template, entfernen Sie Proteinverunreinigungen oder extrahieren Sie Template-DNA mit Reinigungskits.

    ■ Die Denaturierung des Templates ist nicht abgeschlossen ——Erhöhen Sie die Denaturierungstemperatur entsprechend und verlängern Sie die Denaturierungszeit.

    ■ Vorlagenverschlechterung – – Bereiten Sie die Vorlage erneut vor.

    A-2 Grundierung

    ■ Schlechte Qualität der Grundierungen ——Resynthetisieren Sie die Grundierung.

    ■ Primerabbau ——Aliquotieren Sie die hochkonzentrierten Primer zur Konservierung in ein kleines Volumen. Mehrfaches Einfrieren und Auftauen oder Langzeit-Kryokonservierung bei 4 °C vermeiden.

    ■ Unsachgemäßes Design von Primern (zB Primerlänge nicht ausreichend, Dimer zwischen Primern gebildet usw.) -Redesign von Primern (Vermeidung der Bildung von Primer-Dimer und Sekundärstruktur)

    A-3 mg2+Konzentration

    ■ Mg2+ Konzentration ist zu niedrig ——Mg . richtig erhöhen2+ Konzentration: Optimierung des Mg2+ Konzentration durch eine Reihe von Reaktionen von 1 mM bis 3 mM mit einem Intervall von 0,5 mM, um das optimale Mg . zu bestimmen2+ Konzentration für jede Matrize und jeden Primer.

    A-4 Glühtemperatur

    ■ Die hohe Annealing-Temperatur beeinflusst die Bindung von Primer und Template. ——Reduzieren Sie die Glühtemperatur und optimieren Sie den Zustand mit einem Gradienten von 2°C.

    A-5 Verlängerungszeit

    ■ Kurze Verlängerungszeit——Verlängert die Verlängerungszeit.

    F: Falsch positiv

    Phänomene: Negative Proben zeigen auch die Zielsequenzbanden.

    A-1 Kontamination von PCR

    ■ Kreuzkontamination von Zielsequenz- oder Amplifikationsprodukten ——Die Probe, die die Zielsequenz enthält, vorsichtig in die negative Probe pipettieren oder aus dem Zentrifugenröhrchen verschütten. Die Reagenzien oder Geräte sollten autoklaviert werden, um vorhandene Nukleinsäuren zu eliminieren, und das Vorliegen einer Kontamination sollte durch Negativkontrollexperimente bestimmt werden.

    ■ Kontamination mit Reagenzien ——Aliquotieren Sie die Reagenzien und lagern Sie sie bei niedriger Temperatur.

    A-2 Primer

    ■ Mg2+ Konzentration ist zu niedrig ——Mg . richtig erhöhen2+ Konzentration: Optimierung des Mg2+ Konzentration durch eine Reihe von Reaktionen von 1 mM bis 3 mM mit einem Intervall von 0,5 mM, um das optimale Mg . zu bestimmen2+ Konzentration für jede Matrize und jeden Primer.

    ■ Unsachgemäßes Primer-Design und die Zielsequenz weist Homologie mit der Nicht-Zielsequenz auf. ——Grundierungen neu gestalten.

    F: Unspezifische Amplifikation

    Phänomene: Die PCR-Amplifikationsbanden stimmen nicht mit der erwarteten Größe überein, entweder groß oder klein, oder manchmal treten sowohl spezifische Amplifikationsbanden als auch unspezifische Amplifikationsbanden auf.

    A-1 Grundierung

    ■ Schlechte Primer-Spezifität

    ——Grundierung neu gestalten.

    ■ Die Primerkonzentration ist zu hoch ——Erhöhen Sie die Denaturierungstemperatur richtig und verlängern Sie die Denaturierungszeit.

    A-2 mg2+ Konzentration

    ■ Das Mg2+ Konzentration zu hoch ——Mg2+ Konzentration richtig reduzieren: Mg . optimieren2+ Konzentration durch eine Reihe von Reaktionen von 1 mM bis 3 mM mit einem Intervall von 0,5 mM, um das optimale Mg . zu bestimmen2+ Konzentration für jede Matrize und jeden Primer.

    A-3 Thermostabile Polymerase

    ■ Übermäßige Enzymmenge ——Verringern Sie die Enzymmenge entsprechend in Intervallen von 0,5 U.

    A-4 Glühtemperatur

    ■ Die Glühtemperatur ist zu niedrig ——Erhöhen Sie die Glühtemperatur entsprechend oder wenden Sie die zweistufige Glühmethode an

    A-5 PCR-Zyklen

    ■ Zu viele PCR-Zyklen ——Reduzieren Sie die Anzahl der PCR-Zyklen.

    F: Flecken- oder Schmierstreifen

    A-1 Grundierung——Schlechte Spezifität ——Entwerfen Sie den Primer neu, ändern Sie die Position und Länge des Primers, um seine Spezifität zu verbessern; oder verschachtelte PCR durchführen.

    A-2 Template-DNA

    ——Die Matrize ist nicht rein ——Reinigen Sie die Matrize oder extrahieren Sie DNA mit Aufreinigungskits.

    A-3 mg2+ Konzentration

    ——Mg2+ Konzentration zu hoch ——Mg . richtig reduzieren2+ Konzentration: Optimierung des Mg2+ Konzentration durch eine Reihe von Reaktionen von 1 mM bis 3 mM mit einem Intervall von 0,5 mM, um das optimale Mg . zu bestimmen2+ Konzentration für jede Matrize und jeden Primer.

    A-4 dNTP

    ——Die dNTP-Konzentration ist zu hoch ——Reduzieren Sie die dNTP-Konzentration entsprechend

    A-5 Glühtemperatur

    ——Zu niedrige Glühtemperatur ——Glühtemperatur entsprechend erhöhen

    A-6 Zyklen

    ——Zu viele Zyklen ——Optimieren Sie die Zyklenzahl

    F: Wie viel Template-DNA sollte in ein 50-μl-PCR-Reaktionssystem gegeben werden?
    ytry
    F: Wie amplifiziert man lange Fragmente?

    Der erste Schritt besteht darin, die geeignete Polymerase auszuwählen. Reguläre Taq-Polymerase kann aufgrund fehlender 3'-5'-Exonuklease-Aktivität nicht Korrektur gelesen werden, und eine Fehlpaarung verringert die Verlängerungseffizienz von Fragmenten stark. Daher kann normale Taq-Polymerase Zielfragmente, die größer als 5 kb sind, nicht effektiv amplifizieren. Taq-Polymerase mit spezieller Modifikation oder eine andere High-Fidelity-Polymerase sollte ausgewählt werden, um die Verlängerungseffizienz zu verbessern und die Anforderungen der Amplifikation langer Fragmente zu erfüllen. Außerdem erfordert die Amplifikation langer Fragmente auch eine entsprechende Anpassung von Primerdesign, Denaturierungszeit, Extensionszeit, Puffer-pH usw. Üblicherweise können Primer mit 18-24 bp zu einer besseren Ausbeute führen. Um Matrizenschäden zu vermeiden, sollte die Denaturierungszeit bei 94 °C auf 30 Sekunden oder weniger pro Zyklus reduziert werden und die Zeit zum Temperaturanstieg auf 94 °C vor der Amplifikation sollte weniger als 1 Minute betragen. Darüber hinaus kann eine effektive Amplifikation langer Fragmente durch Einstellen der Extensionstemperatur auf etwa 68 °C und Gestaltung der Extensionszeit entsprechend der Rate von 1 kb/min sichergestellt werden.

    F: Wie kann die Amplifikationstreue der PCR verbessert werden?

    Die Fehlerrate der PCR-Amplifikation kann durch die Verwendung verschiedener DNA-Polymerasen mit hoher Genauigkeit reduziert werden. Unter allen bisher gefundenen Taq-DNA-Polymerasen hat das Pfu-Enzym die niedrigste Fehlerrate und die höchste Genauigkeit (siehe beigefügte Tabelle). Neben der Enzymauswahl können Forscher die PCR-Mutationsrate weiter reduzieren, indem sie die Reaktionsbedingungen optimieren, einschließlich der Optimierung der Pufferzusammensetzung, der Konzentration der thermostabilen Polymerase und der Optimierung der PCR-Zykluszahl.

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