Kit für schnelle ortsgerichtete Mutagenese

Schnelle Single-Site- oder Multi-Site-Mutation am Zielgen im Zielvektor.

Die ortsgerichtete Mutagenese in vitro ist eine wichtige experimentelle Methode in verschiedenen Bereichen der Biologie und Medizin, die hauptsächlich zur Modifikation und Optimierung von Zielgenen, zur Erforschung der regulatorischen Stellen von Promotoren sowie zur Untersuchung der komplexen Beziehung zwischen Proteinstruktur und -funktion verwendet wird. Das Kit verwendet die derzeit führende Technologie zur direkten Durchführung von Single-Site-Mutationen, Multi-Site-Mutationen sowie Insertions- oder Deletionsmutationen am Zielgen. Die Mutationsrate der Single-Site-Mutation kann mehr als 90% erreichen. Außerdem ist im Gegensatz zu den herkömmlichen Mutationskits, die mehrere PCR-Runden, Subklonierung und andere zeit- und arbeitsaufwendige Schritte erfordern, die Handhabung des Kits einfacher, und es werden nur vier Schritte benötigt, um den mutierten Stamm zu konstruieren.

Katze. Nein Packungsgröße
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Produktdetail

FAQ

Produkt Tags

Merkmale

■ Einfach und schnell: Das Kit verwendet eine Plasmid-Amplifikationstechnologie ohne Strangsubstitution. Es sind nur 4 Schritte erforderlich, um die Transformation vom Wildtyp-Stamm in den mutierten Stamm zu realisieren, ohne die zeit- und arbeitsaufwendigen Schritte wie mehrere PCR-Runden und Subklonierung.
■ Hocheffizienter Primer: Der Kit basiert auf dem Prinzip des teilweise überlappenden Primerdesigns, so dass durch Amplifikation mehr mutierte Plasmide erhalten werden können.
■ Breite Anwendung: Das Kit kann nicht nur Single-Site-Mutationen, sondern auch Multi-Site-Mutationen durchführen. Es kann bis zu 5 Seiten mutieren.
■ Starke Anpassungsfähigkeit: Der Kit kann auf Plasmiden mit einer maximalen Größe von 10 kb ortsgerichtete Mutationen durchführen und deckt damit grundsätzlich alle gängigen Plasmide ab.
■ Hohe Mutationsrate: Der Kit hat die Funktion, methylierte Plasmid-Templates in vitro und in vivo doppelt zu verdauen, wodurch eine höhere Mutationsrate gewährleistet wird.

Site-Mutation-Reaktions-Setup und PCR-Programm

■ Bei einer Single-Primer-Multi-Site-Mutation ist die Mutationsrate aufgrund der erhöhten Anzahl von Mutationsstellen niedriger als bei einer Single-Site-Mutation. Nach unseren experimentellen Daten wird die mutationspositive Rate auf 50 % reduziert, wenn die Anzahl der Mutationsstellen 5 erreicht. Daher wird in diesem Fall empfohlen, die Anzahl der verifizierten Klone zu erhöhen.
■ Das Kit unterstützt Multi-Primer-Multi-Site-Mutation, so dass Mutationsexperimente gleichzeitig in einem größeren Bereich von Genen durchgeführt werden können. Die Obergrenze der Anzahl der Mutationsstellen liegt weiterhin bei 5.
■ Es wird empfohlen, bei der Durchführung neuer Mutationsexperimente die im Kit mitgelieferten Kontrollplasmide und Primer zu verwenden, um die Analyse experimenteller Probleme zu erleichtern.

Fast Site-Directed Mutagenesis Kit Fast Site-Directed Mutagenesis Kit

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    F: Keine Verstärkungsbänder

    A-1 Vorlage

    ■ Das Template enthält Proteinverunreinigungen oder Taq-Inhibitoren usw. ——Reinigen Sie das DNA-Template, entfernen Sie Proteinverunreinigungen oder extrahieren Sie Template-DNA mit Reinigungskits.

    ■ Die Denaturierung des Templates ist nicht abgeschlossen ——Erhöhen Sie die Denaturierungstemperatur entsprechend und verlängern Sie die Denaturierungszeit.

    ■ Vorlagenverschlechterung – – Bereiten Sie die Vorlage erneut vor.

    A-2 Grundierung

    ■ Schlechte Qualität der Grundierungen ——Resynthetisieren Sie die Grundierung.

    ■ Primerabbau ——Aliquotieren Sie die hochkonzentrierten Primer zur Konservierung in ein kleines Volumen. Mehrfaches Einfrieren und Auftauen oder Langzeit-Kryokonservierung bei 4 °C vermeiden.

    ■ Unsachgemäßes Design von Primern (zB Primerlänge nicht ausreichend, Dimer zwischen Primern gebildet usw.) -Redesign von Primern (Vermeidung der Bildung von Primer-Dimer und Sekundärstruktur)

    A-3 mg2+Konzentration

    ■ Mg2+ Konzentration ist zu niedrig ——Mg . richtig erhöhen2+ Konzentration: Optimierung des Mg2+ Konzentration durch eine Reihe von Reaktionen von 1 mM bis 3 mM mit einem Intervall von 0,5 mM, um das optimale Mg . zu bestimmen2+ Konzentration für jede Matrize und jeden Primer.

    A-4 Glühtemperatur

    ■ Die hohe Annealing-Temperatur beeinflusst die Bindung von Primer und Template. ——Reduzieren Sie die Glühtemperatur und optimieren Sie den Zustand mit einem Gradienten von 2°C.

    A-5 Verlängerungszeit

    ■ Kurze Verlängerungszeit——Verlängert die Verlängerungszeit.

    F: Falsch positiv

    Phänomene: Negative Proben zeigen auch die Zielsequenzbanden.

    A-1 Kontamination von PCR

    ■ Kreuzkontamination von Zielsequenz- oder Amplifikationsprodukten ——Die Probe, die die Zielsequenz enthält, vorsichtig in die negative Probe pipettieren oder aus dem Zentrifugenröhrchen verschütten. Die Reagenzien oder Geräte sollten autoklaviert werden, um vorhandene Nukleinsäuren zu eliminieren, und das Vorliegen einer Kontamination sollte durch Negativkontrollexperimente bestimmt werden.

    ■ Kontamination mit Reagenzien ——Aliquotieren Sie die Reagenzien und lagern Sie sie bei niedriger Temperatur.

    A-2 Primer

    ■ Mg2+ Konzentration ist zu niedrig ——Mg . richtig erhöhen2+ Konzentration: Optimierung des Mg2+ Konzentration durch eine Reihe von Reaktionen von 1 mM bis 3 mM mit einem Intervall von 0,5 mM, um das optimale Mg . zu bestimmen2+ Konzentration für jede Matrize und jeden Primer.

    ■ Unsachgemäßes Primer-Design und die Zielsequenz weist Homologie mit der Nicht-Zielsequenz auf. ——Grundierungen neu gestalten.

    F: Unspezifische Amplifikation

    Phänomene: Die PCR-Amplifikationsbanden stimmen nicht mit der erwarteten Größe überein, entweder groß oder klein, oder manchmal treten sowohl spezifische Amplifikationsbanden als auch unspezifische Amplifikationsbanden auf.

    A-1 Grundierung

    ■ Schlechte Primer-Spezifität

    ——Grundierung neu gestalten.

    ■ Die Primerkonzentration ist zu hoch ——Erhöhen Sie die Denaturierungstemperatur richtig und verlängern Sie die Denaturierungszeit.

    A-2 mg2+ Konzentration

    ■ Das Mg2+ Konzentration zu hoch ——Mg2+ Konzentration richtig reduzieren: Mg . optimieren2+ Konzentration durch eine Reihe von Reaktionen von 1 mM bis 3 mM mit einem Intervall von 0,5 mM, um das optimale Mg . zu bestimmen2+ Konzentration für jede Matrize und jeden Primer.

    A-3 Thermostabile Polymerase

    ■ Übermäßige Enzymmenge ——Verringern Sie die Enzymmenge entsprechend in Intervallen von 0,5 U.

    A-4 Glühtemperatur

    ■ Die Glühtemperatur ist zu niedrig ——Erhöhen Sie die Glühtemperatur entsprechend oder wenden Sie die zweistufige Glühmethode an

    A-5 PCR-Zyklen

    ■ Zu viele PCR-Zyklen ——Reduzieren Sie die Anzahl der PCR-Zyklen.

    F: Flecken- oder Schmierstreifen

    A-1 Grundierung——Schlechte Spezifität ——Entwerfen Sie den Primer neu, ändern Sie die Position und Länge des Primers, um seine Spezifität zu verbessern; oder verschachtelte PCR durchführen.

    A-2 Template-DNA

    ——Die Matrize ist nicht rein ——Reinigen Sie die Matrize oder extrahieren Sie DNA mit Aufreinigungskits.

    A-3 mg2+ Konzentration

    ——Mg2+ Konzentration zu hoch ——Mg . richtig reduzieren2+ Konzentration: Optimierung des Mg2+ Konzentration durch eine Reihe von Reaktionen von 1 mM bis 3 mM mit einem Intervall von 0,5 mM, um das optimale Mg . zu bestimmen2+ Konzentration für jede Matrize und jeden Primer.

    A-4 dNTP

    ——Die dNTP-Konzentration ist zu hoch ——Reduzieren Sie die dNTP-Konzentration entsprechend

    A-5 Glühtemperatur

    ——Zu niedrige Glühtemperatur ——Glühtemperatur entsprechend erhöhen

    A-6 Zyklen

    ——Zu viele Zyklen ——Optimieren Sie die Zyklenzahl

    F: Wie viel Template-DNA sollte in ein 50-μl-PCR-Reaktionssystem gegeben werden?
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    F: Wie amplifiziert man lange Fragmente?

    Der erste Schritt besteht darin, die geeignete Polymerase auszuwählen. Reguläre Taq-Polymerase kann aufgrund fehlender 3'-5'-Exonuklease-Aktivität nicht Korrektur gelesen werden, und eine Fehlpaarung verringert die Verlängerungseffizienz von Fragmenten stark. Daher kann normale Taq-Polymerase Zielfragmente, die größer als 5 kb sind, nicht effektiv amplifizieren. Taq-Polymerase mit spezieller Modifikation oder eine andere High-Fidelity-Polymerase sollte ausgewählt werden, um die Verlängerungseffizienz zu verbessern und die Anforderungen der Amplifikation langer Fragmente zu erfüllen. Außerdem erfordert die Amplifikation langer Fragmente auch eine entsprechende Anpassung von Primerdesign, Denaturierungszeit, Extensionszeit, Puffer-pH usw. Üblicherweise können Primer mit 18-24 bp zu einer besseren Ausbeute führen. Um Matrizenschäden zu vermeiden, sollte die Denaturierungszeit bei 94 °C auf 30 Sekunden oder weniger pro Zyklus reduziert werden und die Zeit zum Temperaturanstieg auf 94 °C vor der Amplifikation sollte weniger als 1 Minute betragen. Darüber hinaus kann eine effektive Amplifikation langer Fragmente durch Einstellen der Extensionstemperatur auf etwa 68 °C und Gestaltung der Extensionszeit entsprechend der Rate von 1 kb/min sichergestellt werden.

    F: Wie kann die Amplifikationstreue der PCR verbessert werden?

    Die Fehlerrate der PCR-Amplifikation kann durch die Verwendung verschiedener DNA-Polymerasen mit hoher Genauigkeit reduziert werden. Unter allen bisher gefundenen Taq-DNA-Polymerasen hat das Pfu-Enzym die niedrigste Fehlerrate und die höchste Genauigkeit (siehe beigefügte Tabelle). Neben der Enzymauswahl können Forscher die PCR-Mutationsrate weiter reduzieren, indem sie die Reaktionsbedingungen optimieren, einschließlich der Optimierung der Pufferzusammensetzung, der Konzentration der thermostabilen Polymerase und der Optimierung der PCR-Zykluszahl.

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